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实体瘤转录组研究

发布日期:2013/9/11 13:15:41      

研究目的

        基于不同的新一代测序研究方案,寻找适用于肿瘤早期诊断、肿瘤分型(在分子水平对疾病能够准确分型)、病程发展(恶化和转移)和预后的转录组分子标记,筛选药物的靶标,用药的分子依据。


研究对象

        实体肿瘤的鉴别,按照临床病理分类,例如:肺癌、胃癌、肝癌、结肠癌、乳腺癌、宫颈癌、胰腺癌、膀胱癌、食管癌、鼻咽癌、肾癌、淋巴瘤等。

        取样标准:肿瘤组织与正常组织有明显区别,组织病理切片分析肿瘤样品中肿瘤细胞的比例在80%以上;正常样品中几乎不含有肿瘤细胞。

新一代测序方案

RNA-seq(poly A 法mRNA测序)发现癌症发生或转移相关的mRNA的变异(几乎所有基因的表达量差异、基因融合和选择性剪切等事件)。

Small RNA-seq(小RNA测序)分析miRNA的表达量差异,预测miRNA作用的靶基因,筛选可用于疾病诊断和预后的分子标记。

lncRNA-seq(长链非编码RNA测序)通过polyA尾抓取和核糖体去除的方法,富集mRNA和lncRNA,可以发现样品中的新lncRNA,并同时检测样本中的mRNA和lncRNA,进行共表达分析,以mRNA的功能富集分析挖掘lncRNA的功能和潜在作用机制,探讨lncRNA和疾病的关系。


案例分析

案例(一)转录组测序用于癌驱动基因的筛选

        2013年,HJ Yang等研究者通过对红外线辐射诱导非小细胞肺癌(NSCLC)A549细胞及非辐射NCI-H460细胞进行全转录组测序,经过GO分析、蛋白网络分析及RT-PCR验证,发现COX-2 (即PTGS2)基因可能作为非小细胞肺癌(NSCLC)抗辐射的标记物。

1. RNA-seq 可检测低表达丰度转录本

图1. 红外线辐射诱导的A549细胞3号染色体上的不同基因的表达情况(横坐标表示染色体位置,
纵坐标表示以400 kb滑动窗口为单位的差异表达基因量)

2. 辐射诱导非小细胞肺癌(NSCLC)A549细胞的GO功能注释分析



图2. 红外线辐射诱导的A549细胞GO (molecular function ontology)分析图

3. 辐射诱导非小细胞肺癌A549细胞的蛋白网络作图

图3. 红外线辐射诱导的A549细胞细胞周期,细胞发育,血液系统发育和功能相关的蛋白网络图

案例(二)RNA-seq用于癌症融合基因的筛选

        2013年,J.Chmielecki等研究者对27个孤立性纤维性肿瘤(solitary fibrous tumor, SFT)患者进行转录组测序,发现了与该罕见疾病发生相关的一个基因融合(NAB2-STAT6)。它使EGR相关代谢平衡遭到破坏,是SFT变异的诱因。


图4. SFT转录组测序检测到的6种NAB2-STAT6融合基因


案例(三)RNA-seq检测癌症SNP等突变位点

        2013年,研究者通过研究两对正常组织及结肠癌组织病人的全转录组测序,检测到418 个基因发生突变,其中与粘蛋白家族相关的3个基因点突变与结肠癌变异相关。

图5. A. 正常样本的SNP位点及Indel统计直方图; B. 肿瘤样本的SNP位点及Indel统计直方图

案例(四)RNA-seq发现RNA编辑

        2013年,研究者通过6例肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)样本的转录组测序(35M reads/样本),发现肝癌样本中的AZIN1的A→G RNA编辑的频率明显增高。AZIN1的A→G RNA编辑有可能是人类癌症,尤其是肝癌发病的一个潜在驱动因子,从而为肝癌的治疗或诊断提供了一个有潜力的新靶点。



图6. A. 个体reads与已知AZIN1参考序列比对,蓝色或紫色阴影表示存在RNA编辑,肿瘤样品中的编辑事件的
序列标签如下,每个字母的高度与编辑频率成正比; B. 样本HCC448N以及HCC448T的 AZIN1基因RNA编辑位置
在DNA及cDNA序列上的情况,箭头所示为编辑位点,基因组上此位点没有改变,cDNA序列上发生了A→G的编
辑; C. 样本HCC448N以及HCC448T 上A→G RNA编辑的频率,在肿瘤样品中RNA编辑的频率明显增高。

案例(五)RNA-seq 检测与癌症相关的可变剪接

        癌基因能够通过选择性剪切调节细胞代谢,这将为药物研发人员提供新的靶标,帮助他们在癌基因的基础上开发出新型药物。2013年,Chen RL等研究者通过对NCBI上已发表的1例肺癌(lung cancer)及1例正常样本的转录组测序数据,发现肺癌样本中存在53种不同的可变剪接。

图7. Cuffdiff展示PIK3R5选择性可变剪接结果(黄色表示可变剪接事件,左边是序列ID;棕色表示ENSEMBL数
据库中所有PIK3R5基因的转录本,底部蓝色条形图表示染色体保守区域)

案例(六)Small RNA测序发现低丰度表达的新miRNA

        研究者通过对乳腺癌及癌旁组织样本进行高通量测序,发现了361个低丰度表达的新miRNA,并发现三分之二的新miRNA可以在其他组织中检测到。

图8. 新发现的miRNA表达量比已知的miRNA低

案例(七)lncRNA可以成为各种肿瘤的生物标志物

         2012斯坦福大学医学院研究人员进行首个大型的癌症lncRNA表达谱分析。对64个肿瘤样品高通量测序,在各种肿瘤类型之间找出差异表达的1065个已知的以及1072新的lncRNA。


图9. 瘤和对照样品lncRNA表达谱分析


参考文献

1. Yang H J, Kim N, Seong K M, et al. Investigation of Radiation- induced Transcriptome Profile of Radioresistant Non- small Cell Lung Cancer A549 Cells Using RNA-seq. PloS one. 2013, 8(3): e59319.

2. Chmielecki J, Crago AM, Rosenberg M, et al. Whole-exome sequencing identifies a recurrent NAB2- STAT6 fusion in solitary fibrous tumors. Nature Genet. 2013; 45: 131–132.

3. Yin H, Liang Y, Yan Z, et al. Mutation spectrum in human colorectal cancers and potential functional relevance. BMC Med Genet.2013; 8; 14:32.

4. Chen L, Li Y, Lin CH, et al. Recoding RNA editing of AZIN1 predisposes to hepatocellular carcinoma. Nat Med. 2013; 19(2): 209-16.

5. Chen RL, Guo W, Shi Y, et al. Computational identification of specific splicing regulatory elements from RNA- seq in lung cancer.Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2013; 17(13):1716- 21.

6. Persson H, Kvist A, Rego N, et al. Identification of new microRNAs in paired normal and tumor breast tissue suggests a dual role for the ERBB2/Her2 gene. CancerRes. 2011; 71: 78- 86.

7. Brunner AL, Beck AH, Edris B, et al. Transcriptional profiling of long non- coding RNAs and novel transcribed regions across a diverse panel of archived human cancers. Genome Biol. 2012; 13(8): R75.


G006 锐博生物——基于新一代测序的实体肿瘤转录组学研究.pdf




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