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高通量测序样品质量及运输要求

发布日期:2012/11/16 15:47:32

一) 组织样本

1、 准备:新鲜剥离,清洗,分割,存于TRIzol/ RNAlater中。

2、 干重:>2g/样品。(注:不同类型的样品DNA/RNA产量差别较大,具体送样量以达到质检要求为准。)

3、 运输方式:72小时内干冰运输。

4、 备份:接收样品前要求客户分装备份,用于样品检测不合格时分析原因。

5、 推荐处理方法:

    l) 冰上预冷生理盐水或PBS(所用溶液及器皿无DNase及RNase);

    2) 从活体切取所需组织,置于平皿;加入预冷的生理盐水或PBS至淹没组织,漂洗去除血渍污物,重复3次以上(该步为冰上操作,操作时间不宜超过10 min);

    3) 用滤纸吸干样品表面液滴,剪成约0.2-0.5cm的小块(组织快越小,保存效果越好);

    4) 放入加有TRIzol或 RNAlater的离心管或冻存管中;  

    5) 液氮速冻后用封口膜封口。

二)细胞样本 (包括培养微生物样本)

1、 准备:高速离心收集细胞,存于TRIzol/ RNAlater中。

2、 贴壁或悬浮细胞:>5X106细胞/样品。(注:不同类型的细胞DNA/RNA产量差别较大,具体送样量以达到质检要求为准。)

3、 微生物:建议选取处于对数生长期的菌液,高速离心收集菌体后,弃上清,加入TRIzol/ RNAlater,液氮速冻后用封口膜封口。

4、 运输方式:72小时内干冰运输。

5、 备份:接收样品前要求客户分装备份,用于样品检测不合格时分析原因。

6、 推荐处理方法:

    l)冰上预冷PBS(无DNase及RNase);

    2)贴壁细胞:去掉培养基后,加入适量预冷PBS漂洗一次,按每10cm2培养面积加1mL TRIzol的比例加入TRIzol,反复吹打使所有细胞充分消化,转移到离心管或冻存管中;

    3)悬浮细胞:离心收集细胞,弃培养液,用预冷PBS漂洗一次,按每5X106细胞加1mL TRIzol的比例加入TRIzol,反复吹打使所有细胞充分消化,转移到离心管或冻存管中;

    4)液氮速冻后用封口膜封口。  


客户自行提取DNA/RNA的样本要求符合锐博提取样本的质检标准;非特殊情况下,客户提供质检信息的样本,接收后都要再次质检,确认样本质量没有在运输过程受影响。

三)DNA样品要求

1、 完整度:基因组DNA要求凝胶电泳图显示主带明显可辨(哺乳动物基因组DNA主带>23Kb);PCR产物要求条带单一。

2、 纯度:OD值介于1.6~2.0;无蛋白质、RNA或肉眼可见污染。

3、 浓度:>30ng/μl。

4、 备份:接收样品前要求客户分装备份,用于样品检测不合格时分析原因。

5、 运输样品时请附1 mL溶解DNA所使用的溶剂。

建库类型

样品类型

检测方法

检测结果

判定结论

基因组De novo测序或重测序文库;Amplicon/Target-Seq文库等

基因组DNA

Qubit,琼脂糖凝胶电泳,NanoDrop

m≥10μg

c≥30 ng/μL

OD260/280≥1.6

OD260/230≥1.5

Level A

 

5μg≤m<10μg

Level B

 

Target-Seq文库

PCR产物或打断后样品

Qubit,琼脂糖凝胶电泳,NanoDrop

m≥4μg

c≥30 ng/μL

OD260/280≥1.6

OD260/230≥1.5

Level A

 

2μg≤m<4μg

Level B

 

ChIP-Seq文库

ChIP样品

QubitAgilent 2100/2200NanoDrop

m≥20 ng

主峰在100-500bp之间

Level A

 

10 ng≤m<20 ng

Level B

 

检测标准说明:

1. 上表中对样品DNA总量(m)的要求主要针对人、鼠来源的样品。对于其他来源的样品,建议以m更高的要求进行送样。

2. 浓度、总量以Qubit检测结果为准,纯度参考NanoDrop检测OD值。

3. Level A为满足两次及两次以上建库的样品标准,Level B为满足一次建库的样品标准。为了保障项目的顺利进行,推荐按照Level A标准进行送样。

4. 如果样品无法满足Level A或B中的任何一项指标,同时由于特殊原因无法再准备更多样品,可根据实际情况进行风险建库测序,但不保证测序质量。

5. 如有任何问题,请在送样前咨询销售代表或技术支持。

检测结果说明(样品分类)

Level A:A类样品,指的是质量满足建库测序要求,且总量可以满足2次或者2次以上建库需要的样品。

Level B:B类样品,指的是质量满足建库测序要求,且总量可以满足1次但不足2次建库需要的样品。


四)RNA样品要求

1、 完整度:28S/18S>1.5;RIN>8。

2、 纯度:OD值介于1.8~2.0;无蛋白质、RNA或肉眼可见污染。

3、 浓度:>400ng/μl。

4、 备份:接收样品前要求客户分装备份,用于样品检测不合格时分析原因。

5、 运输RNA样品时,推荐保存在70%乙醇中(处理方法如下);如寄送溶解后的RNA,请附1 mL溶解RNA所使用的溶剂。

纯化后的RNA运输前处理(推荐):

RNA定量后调体积至100或200μl,加入0.1体积的3M NaAc pH5.2(RNase-free)和2.5体积的无水乙醇;混匀后-20℃以下冰箱放置30min以上;4℃ 13000g离心30 min沉淀RNA;弃上清后加入1.3 ml 无水乙醇,干冰运输。

建库类型

样品类型

检测方法

检测结果

判定结论

RNA-Seq(包括普通转录组及链特异性转录组)

 

人、鼠Total  RNA

Agilent

2100/2200NanoDrop

m≥10μg

c≥65 ng/μL

RIN≥7.0

OD260/280≥1.8

OD260/230≥1.5

Level A

 

5μg≤m<10μg

Level B

 

微量转录组

 

人、鼠 Total  RNA

Agilent

2100/2200NanoDrop

m≥400 ng

c≥5 ng/μL

RIN≥7.0

OD260/280≥1.8

OD260/230≥1.5

Level A

 

200ng≤m<400 ng

Level B

 

LncRNA-Seq

 

人、鼠 Total RNA

Agilent

2100/2200NanoDrop

m≥10 μg

c≥200 ng/μL

RIN≥7.0

OD260/280≥1.8

OD260/230≥1.5

Level A

 

5μg≤m<10 μg

Level B

 

RNA文库

 

Total RNA

Agilent

2100/2200NanoDrop

m≥20 μg

c≥200 ng/μL

RIN≥8.0

28S/18S≥1.5

OD260/280≥1.8

OD260/230≥1.5

Level A

 

10μg≤m<20 μg

Level B

 

检测标准说明:

1. 上表中对样品RNA总量(m)的要求主要针对人、鼠来源的样品。对于其他来源的样品,建议以m更高的要求进行送样。

2. 微量建库与常规RNA-Seq的区别在于使用微量文库构建试剂盒,样品起始量相应降低,但建库价格比常规建库高。建议只针对特殊取样困难的样品使用。

3. 小RNA文库对样品RNA总量(m)的要求主要针对常见细胞、组织等样品的total RNA。对于特殊的微量RNA样本,如血清、血浆、免疫共沉淀或Exosome等来源的小RNA,m≥200ng,c≥1 ng/μL。对于客户自行分离的小RNA(<200nt),送样量≥1 μg。

4. 浓度、总量以Agilent 2200检测结果为准,纯度参考NanoDrop检测OD值。

5. Level A为满足两次及两次以上建库的样品标准,Level B为满足一次建库的样品标准。为了保障项目的顺利进行,推荐按照Level A标准进行送样。

6. 如果样品无法满足Level A或B中的任何一项指标,同时由于特殊原因无法再准备更多样品,可根据实际情况进行风险建库测序,但不保证测序质量。

7. 如有任何问题,请在送样前咨询销售代表或技术支持。


注:检测结果说明(样品分类)

Level A:A类样品,指的是质量满足建库测序要求,且总量可以满足2次或者2次以上建库需要的样品。

Level B:B类样品,指的是质量满足建库测序要求,且总量可以满足1次但不足2次建库需要的样品。

术语和定义

Qubit:Life technologies Qubit® 2.0荧光,或使用Life technologies Qubit® 2.0荧光进行DNA/RNA检测的方法。

Agilent 2100/2200:Agilent 2100/2200 Bioanalyzer,或使用Agilent 2100/2200 Bioanalyzer进行DNA/RNA检测的方法。

NanoDrop:Thermo Fisher NanoDrop ND-1000或任何微量紫外分光光度计,或使用这些仪器进行DNA/RNA检测的方法。

m:总量(Total Mass),DNA/RNA总量。

c:浓度(Concentration),DNA/RNA浓度。

OD260/280:OD260/280比值,DNA/RNA检测中260与280吸光值比值,反映DNA/RNA纯度。

OD260/230:OD260/230比值,DNA/RNA检测中260与230吸光值比值,反映DNA/RNA纯度。

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