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石蜡包埋组织样品制备方法

发布日期:2012/4/3 18:12:20

  组织采集后,经固定、保存、石蜡包埋、切片、展片、烤片,方可进行HE染色(或其它化学染料染色)及免疫抗体标记。

  以下操作依据组织大小及致密程度而定

  1、组织的采集、固定和保存:

  可依据实验目的及组织的特点而考虑采用不同的固定和保存方法。此处只介绍实验室常用方法。

  采取组织后,4%多聚甲醛(4%PFA)4°C 固定1小时(根据组织大小和致密程度调整固定时间)或过夜,PBS缓冲液洗三次,每次10min至1小时,于30%、50%乙醇中各10 min至1小时,4°C保存于70%乙醇中。

  2、组织的包埋、切片、展片及保存:

  固定后的样品经梯度乙醇脱水、二甲苯透明,52-54°C石蜡包埋,常规切片,切片厚4 -10mm,贴于处理过的干净载玻片上,34°C烤片过夜,之后收集于载片盒中,4°C密封保存。

  石蜡包埋:

保存于4°C 70%乙醇中的组织样品

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  80%乙醇  15 min

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  95%乙醇 15 min     

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 100%乙醇  15min X 2

         ¯       

1/2乙醇1/2二甲苯 15 min

  ¯

        二甲苯透明  5-10 min

  ¯

1/2二甲苯1/2石蜡 30 min

  ¯

    石蜡(1  1.5hr

  ¯

        石蜡(2  1.5-2.5hr

  ¯

石蜡(3  包埋

                    ¯

                     4°C保存

  3、石蜡组织切片的化学荧光标记:

  切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇复水,即可进行免疫反应,操作步骤与冰冻组织切片的反应方法相同。

  石蜡组织切片脱蜡、复水步骤:


      密封保存于4°C的组织切片

        ¯

     二甲苯(1)  10 min

        ¯

     二甲苯(2)  10 min

        ¯

     二甲苯(3)  10 min

        ¯

1/2二甲苯1/2乙醇  15 min

        ¯

    100%乙醇  5 min

        ¯

     95%乙醇  5 min

        ¯

     80%乙醇  5 min

          ¯  

     70%乙醇5 min

        ¯

      50%乙醇  5 min

        ¯

     30%乙醇  5 min

        ¯

        d2H2O  5 min

  4、石蜡组织切片的免疫标记:

  切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇复水,即可进行免疫反应,操作步骤与冰冻组织切片的反应方法相同。

  石蜡组织切片脱蜡、复水步骤:


      密封保存于4°C的组织切片

        ¯

     二甲苯(1)  10 min

        ¯

     二甲苯(2)  10 min

        ¯

     二甲苯(3)  10 min

        ¯

1/2二甲苯1/2乙醇  15 min

        ¯

    100%乙醇  5 min

        ¯

     95%乙醇  5 min

        ¯

     80%乙醇  5 min

           ¯   

     70%乙醇5 min

        ¯

      50%乙醇  5 min

        ¯

     30%乙醇  5 min

        ¯

        d2H2O  5 min

  5、石蜡组织切片的HE染色:

  切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇复水,于苏木精中室温染色5-20 min,迅速用水冲洗切片,至组织切片变蓝,镜检。用0.1-0.5%盐酸乙醇分色1~2秒钟,也可用50ml H2O中加一滴氨水分色,效果亦好(如染色程度恰好,也可省略分色步骤)。之后用流水冲洗切片,直至切片变蓝,此称蓝化。切片经梯度乙醇至95%乙醇中,于0.5%伊红中染色1~5秒或更长时间,95%乙醇洗去残色,若颜色太深,可在低浓度的乙醇中脱色,镜检。无水乙醇脱水、二甲苯透明,中性树胶封片。普通光镜观察,室温干燥条件下保存染色切片。

 

石蜡切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇复水

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      苏木精 室温5-10 min

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        H2迅速冲洗

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 0.1%盐酸乙醇  1-2 sec

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          流水滴洗

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         30%乙醇  1 min

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         50%乙醇  1 min

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        70%乙醇  1 min

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        80%乙醇  1 min

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        95%乙醇  1 min

        ¯

       伊红A  1min

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         伊红B  1-30sec

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        无水乙醇  1 min

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          无水乙醇  5min X 2

        ¯

       1/2乙醇1/2二甲苯  15 min

        ¯

        二甲苯(1)  5min

        ¯

        二甲苯(2)  5min

        ¯

        二甲苯(3)  5min

                                                                                 ¯

         中性树胶封片,室温干燥保存

 

 

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