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Nature Cell Biology丨一项重要的细胞重编程研究成果发表

发布日期:2018/4/19 10:59:47      浏览量:

2018312日,国际著名期刊《Nature Cell Biology》(影响因子20.06)刊登了中国科学院广州生物医药与健康研究院Miguel A. Esteban教授团队题为NCoR/SMRT co-repressors cooperate with c-MYC to create an epigenetic barrier to somatic cell reprogramming的重磅成果,研究发现NCoR/SMRT辅阻遏物可结合多能性位点,与c-MYC作用最终导致重编程中的表观遗传障碍,该研究对揭示这一类辅阻遏物在重编程中关键角色有重要意义。

OSKM与转录共同调节因子之间互作诱导机制的难解之谜?

众所周知,体细胞可以通过外源因子OSKM (OCT4SOX2KLF4c-MYC) 来重编程为诱导多能干细胞(iPSCs)。重编程开始时,外源性OSKM与整个基因组的DNA结合并诱导连续的染色质重组,从而激活整个多能性基因网络。然而,OSKM不能单独运作,需要共同调节因子来修饰局部表观遗传环境。但目前尚不清楚OSKM和不同转录共同调节因子(共激活因子和辅阻遏物)之间是如何相互作用或相互拮抗以诱导多能性状态。

Miguel A. Esteban教授团队探索了两个已知的辅阻遏物核受体辅助抑制因子(NCoR)和视黄酸及甲状腺激素受体沉默中介蛋白(SMRT)的功能,证明了NCoR/SMRT辅阻遏物可与多能性位点结合,从而利用4Yamanaka因子(OCT4SOX2KLF4c-MYC)创建一个重编程障碍,发现抑制NCoR/SMRT就可显著提高重新编程效率和动力学。NCoR/SMRT复合物的核心表观遗传亚基-组蛋白去乙酰化酶3HDAC3)可通过诱导多能性位点上的组蛋白去乙酰化而有助于NCoR/SMRT发挥作用。在Yamanaka因子中,主要由c-MYC促进NCoR/SMRT-HDAC3在基因组位点的募集。

最后,研究人员描述了c-MYC是如何对重编程的早期阶段有益,而对后期阶段有害。总体而言,本研究发现了NCoR/SMRT辅阻遏物在重编程中的作用,并在提出了c-MYC的双重功能机制。

论文中的6项重要研究发现

1.NCoR/SMRT辅阻遏物可导致OSKM重编程障碍

图 1

通过RT–qPCRshRNA敲降实验及荧光素酶报告实验等证明抑制Ncor1(编码NCoR)和Ncor2(编码SMRT),或者抑制NCoR/SMRT可增强OSKM重编程。

那么,NCoRSMRT是如何阻碍重编程的呢?通过对OSKM重编程第5天和第9天的Ncor1/2缺失细胞进行RNA-seq(由锐博生物提供),发现Ncor1/2的敲降使得许多MEF富集的体细胞基因在第5天时被上调,在第9天时变得不明显;而多能性相关基因在第9天时被上调(图1)。

因此,OSKM重编程中,抑制Ncor1/2首先会导致体细胞基因抑制中的瞬时缺陷,然后导致多能性基因的加速及更有效的激活。

2.HDAC3对于NCoR/SMRT辅阻遏物损害的重编程至关重要

图 2

HDAC3作为NCoR/SMRT复合物的核心表观遗传亚基,负责复合物的去乙酰化酶活性。研究人员通过RNA-seq分析(由锐博生物提供)及敲降实验发现Hdac3OSKM介导的重编程中表达,且敲降Hdac3显著增加重编程(图2ab)。

随后构建了HDAC3去乙酰化酶无效突变体(HDAC3-YF)、HDAC3双突变体(HDAC3-YF-KA,与NCoR/SMRT相互作用的能力降低),发现HDAC3-YF能有效增强重编程,但这种增强作用在HDAC3-YF-KA突变体中消失,表明HDAC3-YF需要与NCoR/SMRT相互作用才能达到增强重编程的作用(图2cd)。因此推断HDAC3可介导NCoR/SMRT损害OSKM重编程,并且该功能需要去乙酰化酶活性。

3.HDAC3在多能性基因组位点诱导组蛋白去乙酰化

图 3

HDAC3是如何损害OSKM重编程呢?通过免疫印迹分析发现OSKM重编程过程中组蛋白乙酰化水平增加,而NCoR/SMRT缺失或HDAC3-YF过表达导致其水平不再增加。然后在OSKM重编程的第5/9/13天针对H3K27ac进行ChIP–seq以验证其对组蛋白乙酰化的影响(由锐博生物提供),发现大多数H3K27乙酰化(H3K27ac)位于转录起始位点(TSS)附近,有4个多能性位点(Sall4Utf1NanogZic2))在第9/13天时显示H3K27ac的增加,此外,OSKMHDAC3-YF重编程细胞的体细胞基因座中H3K27ac的水平略高,但只在少数情况下且仅在第5天(图3)。表明,HDAC3作为NCoR/SMRT复合物的一部分,通过限制性位点(包括多能性位点)诱导组蛋白去乙酰化而损害OSKM重编程。

4.NCoR/SMRT在重编程中可被募集到多能性位点

图 4

NCoR/SMRT是否会被募集到多能性位点以通过HDAC3诱导组蛋白去乙酰化?研究人员对OSKM重编程第9天的serum+Vc样本进行ChIP–seq(由锐博生物提供),发现很大一部分NCoR/SMRT结合峰是重编程(76%)和ESCs56%)共有的,主要位于TSS附近(图4ab)。进一步分析发现NCoR/SMRT仅在重编程过程中被募集到多能性位点Sox2Prdm4,且这些位点具有更低水平的H3K27ac(图4c),与NCoR/SMRT通过HDAC3损害重编程结果一致。

5.NCoR/SMRT–HDAC3通过c-MYC被募集到多能性位点

图 5

通过免疫共沉淀发现c-MYCNCoR/SMRT-HDAC3复合体之间相互作用。ChIP-seq数据分析发现pre-iPSCsNCoR/SMRTc-MYC有最强的重叠(72%的NCoR/SMRT峰),其次是KLF444%)和OCT4/SOX2~5%),但大多数NCoR/SMRTKLF4的重叠位点被c-MYC共同结合(图5a-d)。OSKM重编程中NCoR/SMRTOCT4SOX2c-MYC同样有很强的重叠,且大部分位点都是共有的(图5e-g)。因此,c-MYC主要帮助将NCoR/SMRT募集到基因组位点(包括多能性位点)以诱导重编程的负效应。

6.外源性c-MYC在重编程中的双重作用

图 6

为了进一步评估c-MYCNCoR/SMRT在抑制多能性基因中的关系,构建了DsRed慢病毒报告基因载体(可通过多能性转录因子的结合直接激活),发现单独的OCT4SOX2KLF4过表达可适当激活报告基因,它们结合后(OSK)的激活效应更强;而单独的c-MYC没有激活效应,结合OSK会损害报告基因活性的增加。Ncor1/2敲降部分缓解了c-MYC对报告基因的负效应(fig8bc)。研究表明通过c-MYCNCoR/SMRT辅阻遏物募集到多能性位点是重编程的负效应力,但将c-MYC添加到OSK中又可增强重编程效率。后续实验证明了外源性c-MYC抑制多能性位点对于通过募集NCoR/SMRT-HDAC3进行重编程的后期阶段是不利的。

锐博生物RNA及ChIP整体方案助力该项成果

本研究中涉及的RNA-seqChIP–seq实验均由锐博生物(RiboBio)提供,锐博生物的RNA测序及服务在国内乃至全球都享有声誉。锐博生物的RNA/DNA研究整体解决方案,涵盖了基因调控、细胞转染、高通量RNA测序、高内涵功能分析和筛选、FISHChIP实验、生物信息分析等各个方面,已受到众多诺贝尔奖获得者研究团队的青睐。

Miguel A. Esteban  本文通讯作者

1994获得西班牙纳瓦拉大学学术学位,2003获得西班牙马德里自治大学博士学位,200712月加入广州生物医药与健康研究院,从事肿瘤干细胞研究。研究领域包括:胚胎干细胞的代谢和细胞周期控制;体细胞诱导产生多能干(iPS)细胞的分子通路;改变氧合(缺氧)对胚胎和癌症干细胞行为的影响等。曾获得多个奖学金及研究奖,并作为英国一联合癌症研究项目的负责人之一。已在国内外知名期刊发表超过100项研究成果。

 




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