请登录|免费注册|
ENGLISH 简体中文
您当前的位置:首页 > 技术资源 > 技术前沿

circRNA研究经典文章解读:From Discovery,Validation to Regulation,Function

发布日期:2017/12/26 11:38:42      浏览量:

今天,小编为大家带来一篇2016年环状RNA经典文章,对环状RNA研究感兴趣的老师不要错过这篇文章哦。

期刊:Nature Communications

影响因子:12.124

作者单位:复旦大学上海医学院

发表时间:2016年4月6日

摘要

环状RNAs(circRNAs)代表一类广泛而多样的内源性RNAs,可调控真核生物中的基因表达。然而,人类circRNAs的调节和功能仍然大部分未知。本研究从六个正常组织和七种癌症的去核糖体RNA测序中检测到至少27000个候选的circRNAs。许多这些circRNAs在正常和癌组织之间差异表达。作者进一步表征了来自HIPK3基因的外显子2的一个丰富的circRNA,称为circHIPK3。circHIPK3沉默(而不是HIPK3 mRNA)显著抑制人类细胞生长。通过荧光素酶筛选试验,观察到circHIPK3具有18个潜在结合位点作为9个miRNAs海绵。具体而言,研究显示circHIPK3直接结合miR-124并抑制miR-124活性。研究结果提供证据表明从前体mRNA产生的环状RNA可能在人类细胞中具有调节作用。

研究背景

来自反向剪接外显子的环状RNAs(circRNAs)最近被鉴定为天然存在的非编码RNA家族,其在真核转录组中高度存在。已经在各种细胞系和不同物种中成功鉴定了大量的circRNAs。最近,已经证明circRNA作为microRNA(miRNA)海绵来调节基因表达。具体而言,含有70多个常规miR-7结合位点的circRNA ciRS-7(也称为CDR1as)已经被鉴定为miRNA抑制剂。然而,只有少数这样的circRNA包含多个结合位点来捕获一个特定的miRNA,并且circRNA的功能仍然大部分是未知的。

研究路线

1、 circHIPK3筛选及鉴定:circRNA高通量测序、生物信息分析、qRT-PCR、Northern blot 、RNA FISH等

2、 circHIPK3生物合成机制鉴定:表达载体(含有不同侧翼的Alu序列的截短体)、CRISPR/Cas9

3、 circHIPK3功能研究:qRT–PCR、RNAi、CCK-8检测、EdU

4、 机制研究:RIP、荧光素酶报告基因、miRNA mimics、ClIP、qRT–PCR、RNA荧光原位杂交

研究结果

circHIPK3筛选及验证

图1

作者通过去核糖体RNA高通量测序共鉴定出27296个环状RNA分子,circRNA在不同组织中的表达模式非常特异(图1a)。生物信息分析显示单个蛋白基因可以产生多个circRNAs,但同一基因起源的circRNA也存在优势表达的circRNA。CircHIPK3由HIPK3基因的2号外显子形成,相比于HIPK3基因产生的其他circRNAs分子表达丰度最高,qPCR检测和测序结果证实circHIPK3的存在(图1b)。FISH显示circHIPK3主要存在细胞质(图1c)。

circHIPK3功能研究

图2

作者通过将2号外显子和侧翼Alu序列分段构建表达载体以及采用CRISPR/Cas9技术,发现circHIPK3成环表达需要两翼Alu序列协助,不可或缺(图2a,2b)。使用siRNA敲降circHIPK3后发现显著抑制肿瘤细胞的增殖能力,EdU实验得到同样的结论(图2c,2d)。而敲降线性HIPK3则无作用。

机制研究

图3

作者借助公共数据分析发现在circHIPK3基因组位置存在许多AGO2结合位点,暗示miRNA可能结合circHIPK3,进一步预测发现circHIPK3序列存在多种miRNA结合位点。通过miRNA靶基因荧光素酶报告基因筛选系统,鉴定9个miRNA对荧光素酶活性有显著抑制效果(图3a)。其中miR-124的抑制效果最为明显(图3b)。共定位实验表明,circHIPK3与miR-124相互结合(图3c)。异位表达的circHIPK3能缓解miR-124抑制增殖的作用。在人的6个正常组织中检测circHIPK3和miR-124的表达,发现在脑中表达最高,表达谱模式正相关,进一步表明circHIPK3和miR-124结合来调控细胞生长(图3d)。

结论

图4

1、 鉴定出人类六种正常组织和七种肿瘤组织中近三万种环状RNA及特征;

2、 鉴定高表达的外显子样环状RNA circHIPK3;

3、 含有多个重复序列的长内含子对circHIPK3生物合成具有重要作用 ;

4、 环状RNA circHIPK3与包括miR-124的9种miRNA结合起调控作用。

本研究中所用siRNA、EdU、miRNA mimics均由锐博生物提供。

原文:Zheng Q, Bao C, Guo W, et al. Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs[J]. Nature communications, 2016, 7.




版权所有:广州市锐博生物科技有限公司 Copyright©2013 Guangzhou RiboBio Co., Ltd.  免费热线:400-686-0075
地址:广州开发区科学城科学大道182号创新大厦C3区13-14层   邮编:510663   粤ICP备05022931号   浏览器建议:IE8.0 1024X768分辨率
.
主营产品及服务:piRNA  寡核酸  siRNA  miRNA  microRNA   RNAi  shRNA  lncRNA  ncRNA  细胞增殖  生物芯片  高通量测序