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曹雪涛院士《Science》文章丨RiboTM lncRNA Smart Silencer产品最新高分文章详细解读

发布日期:2017/12/26 11:08:25      浏览量:

 病毒通过调节宿主的代谢网络来提高它们的生存。然而,对于调控这种代谢变化的分子及其对病毒感染作出反应的机制,仍然是未知的。曹雪涛院士课题组王品博士近期在《Science》发文,鉴定了由病毒诱导且不依赖于干扰素的lncRNA-ACOD1,其可以通过细胞代谢促进病毒复制。

摘 要

病毒通过调节宿主的代谢网络来提高它们的生存。很少知道有调控这种代谢变化的分子能够对病毒感染作出反应,这对于理解病毒感染至关重要。本文中,作者鉴定了由多种病毒诱导的lncRNA(而不是通过I型干扰素(IFN-I)诱导)促进了小鼠和人类细胞中的病毒复制。体内lncRNA-ACOD1的缺失通过IFN-I/IRF3非依赖性途径显著减弱病毒感染。细胞质lncRNA-ACOD1直接结合底物位点附近的代谢酶谷草转氨酶(GOT2),增强其催化活性。重组GOT2蛋白及其代谢物可以挽救lncRNA-ACOD1缺失后的病毒复制,增加致死率。这项工作揭示了病毒诱导的lncRNA通过介导代谢来促进病毒感染的反馈方式,以及开发广泛作用的抗病毒治疗剂的潜在目标。

背景

病毒感染需要改变宿主细胞代谢网络以获得病毒生命周期的构筑块。正链RNA病毒和包膜病毒重新连接脂质代谢复制,丙型肝炎病毒(HCV)引发肝细胞中的肿瘤样谷氨酰胺代谢。尽管一些宿主和病毒编码的microRNAs已被证明部分介导这些代谢途径的改变,但涉及的分子机制在很大程度上仍然不清楚,特别是病毒如何靶向和调节宿主代谢网络的复制和逃离宿主防御。

目前,仅有少数lncRNAs,但越来越多地在不同的过程和疾病中表征,包括感染,先天免疫和获得性免疫。虽然有报道称某些宿主lncRNAs在病毒感染中调控ISGs(干扰素刺激基因)的表达或被干扰素调控,但是关于lncRNAs在感染细胞中的功能的认识仍然非常有限,特别是关于病毒“劫持”宿主代谢复制的机制。

目前报道的lncRNA功能模式主要集中在调控细胞核基因表达,影响细胞信号转导或吸收细胞质中的microRNAs。然而,lncRNAs的作用模式仍有待充分理解。是否还有其他未知的lncRNA活性机制需要进一步探讨。

实验流程

1、lncRNA-ACOD1筛选及其与IFN-I系统的关系:Q-PCR、RNAi、Northern blot、RACE、RNA-seq、荧光素酶报告实验等

2、lncRNA-ACOD1在病毒感染中的作用:Q-PCR、lncRNA-ACOD1 siRNA、CRISPR-Cas9等

3、lncRNA-ACOD1体内功能研究:动物模型、CRISPR/Cas9、RiboTM lncRNA Smart Silencer、RNA FISH、Q-PCR、微阵列转录组分析、LC-MS/MS、流式细胞术、免疫印迹、ELISA等

4、lncRNA-ACOD1与GOT2相互作用(机制研究):Q-PCR、质谱分析、免疫印迹、RNA免疫沉淀、siRNA、LC/MS、RNA FISH等

实验结果

1、lncRNA-ACOD1筛选及其与IFN-I系统的关系

图1

作者对野生型(WT)和IFN-I受体缺陷型(Ifnar-/-)巨噬细胞中有或无水疱性口炎病毒(VSV)感染的lncRNA表达进行了研究。有趣的是,作者发现一组病毒诱导的,不依赖于IFN-I的lncRNAs。对这些不依赖IFN-I的lncRNAs进行RNAi介导的功能性筛选,发现巨噬细胞中的病毒浓度通过敲降基因间lncRNA(其最近的编码基因是ACOD1,命名为lncRNA-ACOD1)而显著下调。作者证实了lncRNA-ACOD1可以被许多独立于IFN-I的病毒所刺激(Fig1A)。此外,lncRNA-ACOD1在大多数细胞和器官中被病毒感染诱导(Fig1B,C)。Northern blot、RACE和RNA-seq显示lncRNA-ACOD1表达伴有poly (A)尾,并且有3个外显子和2个转录变体。核糖体分析数据表明lncRNA-ACOD1缺乏编码潜能(Fig1E)。

图2

使用Irf3-/- 或Ifnar1-/- 细胞和小鼠,发现lncRNA-ACOD1表达独立于IRF3/IFN-I信号传导。药理抑制剂测定显示lncRNA-ACOD1表达主要依赖于核因子-κB(NF-κB)。因此,在lncRNA-ACOD1启动子序列中鉴定了NF-κB复合体RelA的三个结合位点。荧光素酶报告基因实验也表明NF-κB(而非IRF3/IFN-I)参与lncRNA-ACOD1的诱导(Fig2)。

2、lncRNA-ACOD1在病毒感染中的作用

图3

作者发现敲降lncRNA-ACOD1显著降低了巨噬细胞VSV负担(Fig3)。在其他病毒感染中也观察到类似的减少,表明lncRNA-ACOD1通过一般机制促进病毒感染。短时间感染检测表明lncRNA ACOD1不影响病毒进入。使用紫外线照射VSV(UV-VSV)和poly(I:C)刺激细胞发现lncRNA ACOD1对UV-VSV和poly(I:C)反应没有影响,表明lncRNA ACOD1在宿主细胞的病毒复制阶段起作用。利用CRISPR-Cas9敲除lncRNA ACOD1获得相似结果,进一步证实lncRNA ACOD1对病毒复制至关重要。

3、lncRNA-ACOD1体内功能研究

图4

作者构建了lncRNA-ACOD1敲除小鼠,发现在lncRNA-ACOD1缺陷小鼠体内VSV复制显著减少(Fig4AB),同时伴随病理变化的减弱和先天免疫反应的减少。当用致死剂量的VSV感染时,所有lncRNA-ACOD1缺陷小鼠存活,而大多数同胞对照死亡(Fig4C)。在人类中,lncRNA-ACOD1直向同源物也响应于A/PR/8/34型流感病毒(PR8)的病毒感染而被上调,并且其通过RNAi敲降RiboTM lncRNA Smart Silencer导致A549人类肺泡基底上皮细胞中较低的病毒量(Fig4DE),表明lncRNA-ACOD1在促进病毒复制中的功能至少在人和小鼠中是保守的。

图5

lncRNA-ACOD1功能在体内是否也独立于IFN-I/IRF3轴?作者构建了双敲除小鼠(有Ifnar1-/-或Irf3-/-的lncRNA-ACOD1缺陷小鼠)。发现在缺乏IFN-I信号的情况下,lncRNA-ACOD1的缺陷导致VSV增殖的显著抑制和免疫应答的减轻以及致命率明显降低(Fig5)。因此,作者提出lncRNA-ACOD1可能通过一种新的机制而不是经典的IRF3/IFN-I途径来促进病毒复制。

图6

为了检测lncRNA-ACOD1功能是否通过细胞凋亡和自噬发挥作用,作者用流式细胞术和免疫印迹检测了lncRNA-ACOD1的作用,发现宿主细胞凋亡和自噬不受lncRNA-ACOD1的影响。另外,发现lncRNA-ACOD1的敲低或缺失并不影响附近基因的表达,表明lncRNA-ACOD1不具有顺式作用。RNA FISH和RT-PCR试验显示lncRNA-ACOD1位于细胞质,指示它可能与细胞质分子或蛋白质相互作用(Fig6)。

图7

微阵列转录组分析显示lncRNA-ACOD1的缺失导致了许多代谢相关基因表达水平的变化。代谢途径是受lncRNA-ACOD1缺失影响的最重要途径,表明lncRNA-ACOD1可能在病毒感染期间的代谢调节中起作用。使用LC-MS/MS进行全面的代谢组学研究显示病毒感染导致WT细胞的大量代谢变化,这种变化可被lncRNA-ACOD1缺陷所消除(Fig7)。

4、lncRNA-ACOD1与GOT2相互作用(机制研究)

图8

作者使用修饰的ChIRP纯化内源性lncRNA-ACOD1复合物来寻找lncRNA-ACOD1相互作用分子。通过质谱分析及免疫印迹确定了GOT2(一种关键代谢酶)是lncRNA-ACOD1的结合蛋白(Fig8A)。使用GOT2特异性抗体的RNA免疫沉淀(RIP)测定显示lncRNA-ACOD1(但不是其他测试的RNA)在GOT2抗体复合物中高度富集(Fig8B)。并且lncRNA-ACOD1不影响GOT2的表达水平。

图9

lncRNA-ACOD1是否通过GOT2起作用?作者发现GOT2敲降显著降低VSV复制和免疫反应(Fig9CD);并且发现在对照细胞中lncRNA-ACOD1过表达促进病毒复制和免疫反应,而在GOT2敲降的细胞则无影响(Fig9E),表明GOT2的敲降阻断lncRNA-ACOD1的活性。此外,用重组活性的GOT2补充细胞挽救了lncRNA-ACOD1敲降和GOT2敲低的作用,从而促进病毒复制(Fig9FG)。因此,作者提出病毒诱导的lncRNA-ACOD1反馈通过直接结合代谢酶GOT2促进病毒复制。

图10

lncRNA-ACOD1是如何结合并影响GOT2功能?作者通过eCLIP和质谱分析发现lncRNA-ACOD1主要通过5’端(约165-390的核苷酸序列)与GOT2相互作用(Fig10A),并且从GOT2的小区域发现了15个残基肽(54-68氨基酸残基)作为lncRNA-ACOD1的结合位点(Fig10B)。

图11

从结构上看,结合肽在空间上接近于底物位点,lncRNA-ACOD1是否可能影响GOT2的酶活性?体外酶促反应动力学测定及HPLC-MS检测发现lncRNA-ACOD1增强了GOT2的催化活性,取决于其5'结合位点(Fig11D)。另外,作者发现在lncRNA-ACOD1缺陷小鼠中GOT2代谢物,L-天冬氨酸和α-酮戊二酸显著降低,表明GOT2酶活性被体内lncRNA-ACOD1的缺陷所抑制(Fig11E)。使用GOT2代谢物能够挽救lncRNA-ACOD1缺陷小鼠中病毒复制的抑制,从而促进病毒在体内的复制并增加致死率(Fig11FG)。表明病毒感染诱导的lncRNA-ACOD1反馈通过促进GOT2催化活性及其代谢物促进病毒复制。

总的来说,作者发现了转氨酶GOT2在接近底物生态位与病毒诱导的lncRNA-ACOD1最保守的15个残基部分相互作用,通过模拟GOT2活性及其代谢物,lncRNA-ACOD1促进病毒复制和感染。作者鉴定的病毒感染诱导的lncRNA通过NF-κB而不是IFN-I途经操作代谢酶结合机制从而促进病毒感染。这代表了病毒利用宿主代谢网络存活的一种新方法,提供了代谢调节和病毒感染的洞察力,这可能与涉及代谢功能障碍和病毒感染的临床疾病相关,其中lncRNA-ACOD1可能是干预的有用靶标。

原文:Wang P, Xu J, Wang Y, et al. An interferon-independent lncRNA promotes viral replication by modulating cellular metabolism[J]. Science, 2017: eaao0409.




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