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突破性研究丨探索snoRNA如何调节mRNA 3'末端加工

发布日期:2017/12/26 10:10:18      浏览量:

 mRNA 3'末端加工是基因表达中的重要步骤。已经确定的是,由几十种反式作用蛋白质组成的大分子机器可规范真核生物pre-mRNA 3'加工。然而,RNA是否在这个过程中发挥作用仍然是未知的。中山大学姚成果课题组近期发表在《Nucleic Acids Research》上的研究为我们回答了这一问题。该研究被NAR评为Breakthrough Article。

摘  要

作者发现了一类与哺乳动物mRNA 3'加工复合物相关的小核仁RNAs(snoRNAs)。这些snoRNAs主要与切割及多聚腺苷酸化特异因子(CPSF)的一个组成部分Fip1相互作用。作者已经对其中的一个snoRNA进行了功能鉴定,结果表明,U/A富集的SNORD50A通过阻断Fip1-poly(A)位点(PAS)相互作用抑制mRNA 3'加工。SNORD50A的减少改变了Fip1-RNA的相互作用,并改变了一组基因的可变多聚腺苷酸化(APA)谱和转录水平。总之,实验数据揭示了snoRNA的新功能,并提供了第一个证据表明非编码RNAs可能在调节mRNA 3'加工中起重要作用。

Fig. SNORD50A介导的mRNA 3'加工调控的示意模型

研究流程

1、mRNA 3'加工复合物相关snoRNA鉴定:pull-down、Western blot、体外mRNA 3'加工测定、RNA-seq、Northern blot、RT-qPCR

2、体内体外功能验证:体外切割/多聚腺苷酸化测定、构建双荧光素酶报告基因载体、反义寡核苷酸(ASO)

3、SNORD50A调节APA和内源mRNA的表达水平:PAS-seq

4、snoRNA介导的mRNA 3'加工调节机制之确定直接结合体:免疫沉淀、RT-qPCR、pull-down、CLIP、CLIP-seq

5、snoRNA介导的mRNA 3'加工调节机制之SNORD50A如何影响mRNA 3'加工:免疫沉淀、western blot、pull-down、凝胶阻滞实验、Northern blot、RNA-IP实验

6、snoRNA介导的mRNA 3'加工调节机制之SNORD50A如何影响内源性mRNA 3'加工:RT-qPCR、双荧光素酶报告基因、生物素-RNA IP、Fip1 iCLIP-seq

(本研究涉及的测序由锐博生物提供)

实验结果

1、mRNA 3'加工复合物相关snoRNA鉴定

作者之前已经纯化了人mRNA 3'加工复合物,并对其蛋白质组成进行了全面分析。为了探讨可能存在的与这个复合物相关的RNA。作者提取相关RNA并进行高通量测序分析(图1A)。

首先,作者使用一种常用的PAS RNA底物SV40 late (SVL) PAS用于体外mRNA 3'加工测定作者将RNA底物在3'末端生物素化,然后与链霉亲和素磁珠结合。使用生物素-链霉亲和素pull-down纯化RNA-蛋白复合物。Western blot分析显示所有已知的3'加工因子,包括Wdr33,CPSF30,CPSF160,CstF64,CstF64т都与野生型PAS RNA特异性相关,但不与突变型RNA(图2B)。这些结果与先前的研究高度一致,表明生物素-链霉亲和素pull-down策略是高度特异性的,适用于鉴定mRNA 3'加工复合物的成分。

 接下来,作者从纯化的人mRNA 3'加工复合物中提取RNA,构建RNA-seq文库并进行深度测序分析。发现与突变型RNA pull-down样品相比,有11个RNA富集在SVL RNA pull-down样品中,值得注意的是几乎所有富集的RNA都对应于snoRNAs。结果表明特异性snoRNA与mRNA 3'加工有关。后续的Northern blot(图3A)或RT-qPCR分析(图3B)证实了测序分析高度可高。

鉴于这个惊奇的发现,作者提出疑问:在以上纯化条件下是否捕获到了标准的snoRNP颗粒?为此,使用Western blotting分析纯化的mRNA 3'加工复合物中已知的核心snoRNP蛋白(如角质蛋白,NOP58和纤维蛋白原)。发现在pull-down样品中未检测到这些蛋白(图2B),表明与mRNA 3'加工复合物相关的snoRNA未组装到标准snoRNP中。

2、SNORD50A体外/体内抑制SVL PAS 3'加工

mRNA 3'加工复合物相关snoRNA是否在mRNA 3'加工中起作用?作者注意到SVL mRNA 3'加工复合物中最富集的snoRNA SNORD50A(图3A)。

作者首先检测了SNORD50A对体外mRNA 3'加工的影响。为此,作者在有SNORD50A梯度增加的情况下进行了体外切割/多聚腺苷酸化测定发现SNORD50A以剂量依赖性方式显著抑制SVL切割/多聚腺苷酸化效率,而对照SNORA78没有作用,表明SNORD50A可以在体外特异性抑制SVL PAS的mRNA 3'加工(图4A, B)。

为了测试SNORD50A在体内的作用,作者使用过表达SNORD50A载体系统和对照snoRNA(SNORA16A,SNORD20和SNORA78),构建双荧光素酶报告基因载体pPAS-PORT。研究结果表明,与其他对照snoRNAs相比,SNORD50A的过表达显著抑制SVL 3'加工效率(图5B),揭示SNORD50A可以在体内特异性抑制SVL PAS的mRNA 3'加工。

为了进一步研究SNORD50A在体内的功能,作者接下来使用反义寡核苷酸(ASO)减少HeLa细胞中的SNORD50A。与之前的结果一致,SNORD50A在ASO转染后特异性减少了90%(图5C)。研究结果表明,SNORD50A敲降后,SVL PAS的mRNA 3'加工效率适度增加(图5D)。因此,体内和体外实验分析提供了一致且强有力的证据表明SNORD50A负调节SVL PAS的mRNA 3'加工。

3、SNORD50A调节APA和内源mRNA表达水平

许多核心mRNA 3'加工因子或其相关蛋白在体内调节APA和转录本丰度,并且它们的影响是基因特异性。作者提出疑问:SNORD50A是否可以影响APA和基因表达谱?因此PAS-seq(3PC)分析检测了对照和SNORD50A敲降HeLa细胞之间157个基因的显著APA变化。其中,65个基因显示向远端PASs转移,而92个基因显示向近端PAS的转移(图6A)。除了APA变化外,在SNORD50A敲降的HeLa细胞中,1290个基因的mRNA水平上调,878个基因下调(>2-fold);大于4-fold时有477个基因上调,60个基因下调(图6B)。图6C显示了APA和基因表达变化的代表性实例。这些结果表明SNORD50A可调节一类基因的表达,其作用大部分为负调节。

4、mRNA 3'加工复合物相关snoRNA直接与Fip1结合

为了阐述snoRNA介导的mRNA 3'加工调节机制,作者开始确定mRNA 3'加工复合物中这些snoRNA的直接结合配偶体。为此,免疫沉淀(IP)许多已知的3'加工因子,提取其相关RNA并使用四个最高富集的snoRNAs进行RT-qPCR分析。有趣的是,发现所有四个snoRNAs在Fip1 IP样品中都是最高富集,除了Fip1,snoRNA还与其他一些具有中等效率的CPSF亚基相关联(图7A)。为了进一步测试CPSF和snoRNA之间的关联,作者进行了生物素化snoRNA和HeLa NE的pull-down实验。研究结果表明,与生物素化随机RNA和SNORA78相比,CPSF亚基在生物素化snoRNAs pull-down样品中大量富集(图7B)。这些数据表明snoRNA的一个子集至少部分是通过结合CPSF复合物而与mRNA 3'加工复合物结合。

为了确定哪些CPSF亚基在体内直接与这四种snoRNA结合。使用针对五个CPSF亚基的抗体进行CLIP,并进行RT-qPCR以检测特异性靶RNA。作者发现与其他CPSF亚基的IP样品相比,Fip1 IP样品中的四个snoRNA显著丰富(图8B)。之前的CLIP-seq数据显示CPSF亚基结合所有四个snoRNA,并且Fip1具有SNORD50A和snoRD22的最高CLIP-seq信号。根据之前的结果,没有在Fip1 IP样本中检测到任何规范的snoRNP蛋白(图8D)。总之,这些结果强烈地表明snoRNA的一个子集与mRNA 3'加工有关,至少部分通过直接结合Fip1。

5、SNORD50A阻止Fip1-PAS相互作用

作者接下来想检验SNORD50A-Fip1的相互作用是否影响以及如何影响mRNA 3'加工作者首先猜想SNORD50A是否调节Fip1与mRNA 3'加工复合物中的RNA或其他蛋白质之间的相互作用。在切割/多聚腺苷酸化条件下孵育SVL pre-mRNA底物,免疫沉淀Fip1,并从IP样品中提取RNA或蛋白质。IP样本的western blot分析检测到相似数量的CPSF160,CPSF73和CPSF30,表明SNORD50A消耗对Fip1与其他3'加工因子的相互作用影响不大(图9C)。相比之下,在SNORD50A消耗的样品中,通过Fip1 IP回收更多的SVL RNA底物,表明SNORD50A抑制Fip1与SVL PAS RNA的相互作用(图9C)。

SNORD50A如何抑制Fip1与SVL pre-mRNA之间的相互作用?作者提出了两个假设:第一、SNORD50A通过碱基对结合SVL PAS,所得RNA双链体抑制Fip1与SVL的结合。第二、SNORD50A可能与Fip1相互作用,从而阻止与SVL PAS的Fip1相互作用。为了测试第一个假设,放射性标记的SVL PAS RNA序列与SNORD50A之间的生物素-链霉亲和素pull-down实验显示SVL PAS在体外没有与SNORD50A相互作用(图10D)。表明SNORD50A不与SVL PAS RNA杂交

接下来检验第二个假设, SNORD50A与SVL PAS RNA竞争结合Fip1的可能性很大。Fip1通过其富含精氨酸的C末端区域(Fip1-C)与RNA结合。使用重组Fip1-C(GST-Fip1-C)和SVL PAS RNA进行凝胶阻滞实验。实际上,GST-Fip1-C与SNORD50A和SVL PAS上游元件(USE)结合。研究结果表明,SNORD50A在竞争结合Fip1-C中胜过SVL USE,而不是SNORA78(图11E)。

以上结果表明,SNORD50A直接与Fip1结合,作为SVL PAS 3'加工的竞争性抑制剂。有趣的是,SNORD50A在纯化的mRNA 3'加工复合物中被鉴定。那么这种抑制性snoRNA如何并入mRNA 3'加工呢?考虑到Fip1 IP和RT-qPCR数据,作者假设SNORD50A结合Fip1,通过与其他CPSF亚基的相互作用而组装成mRNA 3'加工复合物。使用SVL PAS和用对照siRNA或Fip1 siRNA转染的HeLa细胞的核提取物进行RNA-生物素pull-down实验(图12A)。Northern blot分析显示,使用Fip1 siRNA处理的HeLa细胞的核提取物时,在SVL PAS上组装较少量的SNORD50A(图12B)。HeLa NE的CPSF73 IP实验结果一致(图12B)。有趣的是,Fip1 KD没有影响CPSF复合体的完整性或CPSF对SVL PAS的募集(图12B)。这些结果表明Fip1确实介导了SNORD50A对CPSF的募集,反过来又介导mRNA 3'加工复合物

接下来,作者将放射性标记的SVL PAS RNA与HeLa NE一起孵育,并使用针对WDR33或CPSF30的抗体进行RNA-IP实验来研究SNORD50A是否也阻止其他CPSF亚基与SVL PAS的相互作用结果表明,SNORD50A或Fip1的敲低对WDR33和CPSF30与SVL PAS之间的关联没有显著影响(图13C)。这些数据表明,SNORD50A特异性地阻止了Fip1与SVL PAS的相互作用。

6、SNORD50A至少部分通过调节Fip1与PAS的相互作用来调节内源mRNAs 3'加工

为了确定snoRNA是否以及如何影响内源性mRNA 3'加工,作者从SNORD50A KD细胞中的477个上调基因中选择SNORD50A的几个直接靶点,并描述SNORD50A介导的细胞PASs调节的机制,作者重点研究了只有一个PAS的106个基因。

作者选择了几个高的mRNA靶标进行进一步验证。与PAS-seq数据一致, RT-qPCR分析证实SNORD50A消耗时三种选择的mRNA的表达升高(图14D)。作者假设三个mRNA的上调可能是由于SNORD50A消耗后mRNA 3'加工更有效。为了测试这个想法,使用双荧光素酶报告基因测量了snoRNA靶基因PASes的mRNA 3'加工效率。实际上,SNORD50A敲降细胞中所有三种PASes都观察到较高的mRNA 3'加工活性(图14E)。相比之下,β-肌动蛋白和podxl2基因的PAS活性不受SNORD50A消耗的影响。这些数据强烈地表明,SNORD50A抑制体内特异性PASes的3'加工

接下来,作者进一步研究SNORD50A对这些内源性PASes的影响。首先,在体外合成了这些PASes,并使用如前所述的HeLa NE进行生物素-RNA IP。发现这些生物素化RNA有效地降低了CPSF因子和SNORD50A(图15A)。这些结果表明,SNORD50A与内源性PAS序列上组装的mRNA 3'加工复合物有物理相关性。

这又促使作者去研究SNORD50A是否系统地影响体内PAS区域的Fip1-mRNA相互作用。因此,作者在对照和SNORD50A KD HeLa细胞中进行了Fip1 iCLIP-seq结果表明,Fip1优先结合A(A/U)UAAA六聚体上游的RNA序列和对照HeLa细胞中的切割/多聚腺苷酸化位点。然而,在SNORD50A KD细胞中,Fip1 RNA结合位点分布更广泛,相对于A(A/U)UAAA,中位数位移为15个核苷酸(图16B)。此外,在SNORD50A KD的PAS序列周围观察到显著更高的Fip1ICLIP-seq信号,如Ptch2 mRNA(图16C,D)。这些结果与SVL底物的体外分析一致,支持SNORD50A阻断Fip1与PAS的相互作用并抑制mRNA 3'加工和靶mRNA表达水平的模型

为了了解更高的Fip1-PAS相互作用对这类基因的表达水平有何影响,首先根据SNORD50A敲降和对照细胞之间的倍数变化值将表达的基因分为三组,即上调,不变和下调基因。发现SNORD50A敲除后,对于所有三组,PAS区周围检测到显著更高的Fip1 iCLIP-seq信号(图17B)。在寻找可能解释这种特定基因调控模式的序列特征时,作者检查了100个最上调基因的PAS序列。研究结果表明,与其他组的PAS相比,这些PAS在切割/多聚腺苷酸化位点(-100至100nt)周围更富含U,在-100至-30nt区域观察到最显著的U富集(图17A)。Fip1主要与PASes U富集的上游元件相互作用,这一结果与SNORD50A通过调节Fip1-RNA相互作用来调节mRNA 3'加工和mRNA表达的模型是一致的。

原文:Huang C, Shi J, Guo Y, et al. A snoRNA modulates mRNA 3΄ end processing and regulates the expression of a subset of mRNAs[J]. Nucleic Acids Research.




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