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本是同根生,相煎何太急 | 病毒小RNA降解同源RNA,使哺乳类动物获得抗病毒免疫力

发布日期:2017/12/26 9:07:27      浏览量:

6月21日,中国科学院武汉病毒研究所研究员周溪课题组与军事医学科学院微生物流行病研究所研究员秦成峰课题组合作,在抗病毒免疫研究方面取得新进展,揭示了RNA干扰(RNAi)通路在哺乳动物中具有抗病毒免疫功能。相关研究成果以Human virus-derived small RNAs can confer antiviral immunity in mammals为题发表在Immunity上(IF:24.082)。

人们对RNA干扰(RNAi)能否作为哺乳动物的抗病毒免疫力这一问题一直不甚清晰。本文阐述了RNAi抑制了3A蛋白的活性,从而产生了源于病毒的siRNA产物,最终导致病毒数量下降,而这个病毒诱导的RNAi在人的体壁细胞和小鼠中起着抗病毒的作用。

研究结论

1、3A蛋白是病毒型RNAi抑制物(viral suppressor of RNAi,VSR)

2、在人体壁细胞和小鼠中,VSR缺陷型的HEV71会产生病毒源性的siRNA产物

3、来源于 HEV71的siRNA装载进AGO中并使同源的HEV71 RNA降解。

4、Dicer的缺失能恢复VSR缺陷型HEV71的复制。

摘要

研究者以人类肠病毒71(HEV71)作为模型,揭示了HEV71 3A蛋白在病毒感染期间起着抑制病毒复制的作用。在人细胞和小鼠中,当3A介导的RNAi被破坏时,突变的HEV71能产生大量的有着典型siRNA特性的小RNA。这些来源于病毒的siRNA由病毒的dsRNA在复制期间产生并依赖于Dicer,然后被装载到AGO中,对同源的病毒RNA。在人体壁细胞与小鼠中,3A缺陷型的重组病毒HEV71能显著地被RNAi所抑制,然而 Dicer不足恢复了HEV71的感染(Dicer deficiency rescued HEV71 infection independently of type I interferon response.)。因此,在哺乳类动物中,由人类病毒诱导的RNAi有着抗病毒免疫的功能。

科学理论

本文从HEV71中鉴别出了一个非结构蛋白3A,它作为VSR抑制了Dicer介导的siRNA。在哺乳类动物体壁细胞和小鼠中,当3A介导的RNAi抑制被点突变所破坏时,VSR缺陷的突变型病毒HEV71有效地引发了RNAi应答,产生了大量来源于HEV71,有着siRNA的所有特性和功能的小RNA,这些小RNA依赖于Dicer,从病毒的dsRNA复制中间物中产生,被装载进入AGO-RISC,有着降解同源的病毒基因组RNA的活性。更重要的是,当Dicer缺乏是,VSR缺陷型突变病毒HEV71恢复了其感染能力,不受I型干扰素的影响。

研究路线及主要技术

研究结果

1、3A蛋白是HEV71的潜在VSR,通过与长dsRNA结合来对RNAi起抑制作用

将编码EGFP和EGFP特异性shRNA的载体,和HEV71非结构蛋白的载体共转染到人类HEK293T细胞中,两天后通过northern blot 和western blot检测EGFP mRNA水平和蛋白的表达。研究者发现3A蛋白以及它的前提3AB有效地恢复了EGFP的mRNA水平(图1A,8、9列),提示着3A蛋白是潜在的VSR。此外,knockdown AGO2能抑制shRNA诱导的RNAi(图1A,第12列)(靶向AGO2的siRNA由锐博生物提供)

3A在结构上有着与B2(已被证实的VSR)相似之处,而B2就是通过从Dicer的剪切中阻隔dsRNA来抑制RNAi的。为了验证HEV71 3A是否也能与长dsRNA结合,研究者利用地高辛标记的长dsRNA与不同浓度的MBP-3A融合蛋白共孵育来进行试验。结果显示HEV71 3A能在体外与长dsRNA结合(图1B,3-6列)。

根据以往的文献报道以及实验结果,研究者得到了3A的突变位点Asp23,并且通过qRT-PCR及notrhern blot验证了Asp23和Arg34位点突变为丙氨酸后(D23A和R34A)能显著降低3A抑制RNAi的能力(图1C,图1D,8、9列),并且突变使得HEV71 3A不能再与dsRNA结合(图1E),提示着3A是通过与长dsRNA结合来对RNAi起抑制作用的。

接下来研究者探究HEV71 3A是否也能从Dicer的剪切中阻隔dsRNA。notrhern blot的结果显示,与表达空载的细胞相比,Dicer剪切而成siRNA的丰度在表达3A的细胞中要显著降低,而D23A和R34A突变了的3A则不能抑制shRNA转变为siRNA(图1F)。

为了进一步验证,研究者利用与Dicer结合的200nt dsRNA和MBP-3A融合蛋白及突变型3A分别进行试验。当只有MBP或MBP-3A突变型,dsRNA能高效地转变为22nt的siRNA,一旦加入MBP-3A,则阻止了dsRNA被Dicer剪切siRNA(图1G)。综上所述,HEV71 3A在体外是通过阻止dsRNA被Dicer剪切来抑制RNAi。

2、VSR缺陷型的HEV71能在被其感染的人体壁细胞中产生有RNAi活性的siRNA

为了模拟人体感染病毒的环境,研究者用突变了3A蛋白的HEV71病毒VR1432和野生型病毒来感染人RD细胞, 发现突变型的病毒(HEV71D23A和HEV71R34A)比起野生型的病毒在RD和283T细胞中的生长要弱(图2D),提示着VSR功能的缺失造成了HEV71病毒复制的抑制。

通过深度测序初步证实了野生型HEV71感染的293T细胞能产生病毒性的小RNA(vsRNA),但这些vsRNA并不能变为有活性的siRNA(图3A,测序服务由锐博生物提供)。

接下来,研究人员通过两个不同的RNA oligo 探针检测到被HEV71D23A和HEV71R34A感染的293T和RD细胞中的病毒性siRNA(图4B)。但有趣的是,通过基因编辑技术使Dicer缺失时,被HEV71D23A感染的NoDice 293T细胞中的vsRNA减少了,而能检测到的vsRNA也没有siRNA的特性,提示着有活性的siRNA的产生依赖于Dicer。

至此,研究者证实了HEC71 3A是VSR,且当其介导的RNAi抑制被破坏时,在人体壁细胞中能检测到大量的依赖于Dicer的病毒性siRNA。

既然如此,那这些由VSR缺陷型的HEV71所产生的RNAi是否对人体壁细胞起到抗病毒的作用呢?

研究者用野生型和VSR缺陷型的HEV71感染293T和RD细胞,检测了病毒性RNA丰度、病毒滴度、病毒粒子数以及病毒性siRNA。一如他们预期的那样,在293T和RD细胞中的HEV71D23A和HEV71R34A数量和滴度都较低(图5A、5B),而病毒性的siRNA则明显检测得到(图4A,4B和5B)。更重要的是,在293T或RD中knockdown Dicer后,恢复了HEV71D23A和HEV71R34A的复制能力(图5A,5B)(靶向人Dicer 的siRNA由锐博生物提供)。Dicer的缺乏使病毒性siRNA被清除了,这与深度测序的结果相一致(表S1,测序服务由锐博生物提供

3、来源于 HEV71的siRNA装载进AGO中并使同源的HEV71 RNA降解

哺乳类动物的RNAi通路中,siRNA都是装载进AGO2中起到降解同源RNA的作用。研究者通过用AGO的抗体进行RNA免疫沉淀(RNA-IP)来验证HEV71产生的siRNA是否能转载入AGO-RISC中,结果如图5B所示。

研究者构建了转录含有egfp ORF和600-700nt HEV71基因组的载体EGFP-HEV71600–700,这个载体中的HEV71基因片段没有任何可预测到的二级结构,并且与HEV71D23A的病毒性siRNA同源互补,而不含互补序列的载体EGFP-HEV711200–1300作为阴性对照。 两个载体都不能产生dsRNA,如此一来它们只能被HEV71产生的siRNA所介导的RNAi剪切而不会被Dicer剪切。如图5C所示,感染了HEV71D23A的细胞中其EGFP-HEV71600–700的mRNA 水平较感染了野生型HEV71的要明显降低,而EGFP的表达则没有受到影响。

4、在初级体壁细胞和小鼠中,病毒性RNAi抑制VSR缺陷型HEV71的复制

最后,研究者在动物模型的细胞中验证了病毒性siRNA的效果。从8到10周龄的野生型或Ifnar1-/-C57/B6小鼠中分离初级肺纤维母细胞(MLF),然后分别感染野生型的HEV71和HEV71D23A。结果显示,VSR缺陷使得病毒的复制和病毒颗粒的产生在野生型或Ifnar1-/-C57/B6小鼠MLF中都受到了抑制(图6A,6B)。此外,Ifnar1-/-C57/B6小鼠MLF感染了HEV71D23A之后,能产生nothern blotting检测到的病毒性siRNA(图6C)而感染野生型的HEV71则不能。




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