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外泌体研究策略:SMSC-140-Exos可增强软骨组织再生并预防膝骨关节炎

发布日期:2017/12/25 17:42:35      浏览量:

 上海交通大学附属第六人民医院最近研究发现了一个miR-140-5p过表达人滑膜间充质干细胞衍生的外泌体,研究揭示其可增强软骨组织再生并预防大鼠模型中膝骨关节炎,通过修饰细胞衍生的外泌体具有很大治疗潜力。相关研究结果发表在Theranostics上。

摘要

骨关节炎(OA)是全世界最常见的关节疾病。miR-140-5p过表达的滑膜间充质干细胞(SMSC-140s)衍生的外泌体治疗OA可能有效。作者假设SMSC-140衍生的外泌体(SMSC-140-Exos)可增强关节软骨细胞(AC)的增殖和迁移能力,而不会损害细胞外基质(ECM)分泌。研究结果表明外泌体携带的Wnt5a和Wnt5b通过交替Wnt信号通路激活YAP,并增强软骨细胞的增殖和迁移,具有显著降低ECM分泌的副作用。高表达的miR-140-5p通过RalA阻断了这种副作用。 SMSC-140-Exos增强了ACs的增殖和迁移,而不会在体外损伤ECM分泌;而在体内,SMSC-140-Exos在大鼠模型中成功地阻止了OA。突出显示了SMSC-140-Exos在防止OA方面的潜力。

研究机制

Wnt5a和Wnt5b通过交替Wnt-YAP/TAZ信号通路激活YAP。YAP的激活导致软骨细胞增殖和迁移的增强,并产生SOX9表达和ECM分泌减少的副作用。在SMSC-140-Exos中高表达的miR-140-5p帮助下,SOX9通过RalA抑制而被拯救,ECM分泌成功恢复。

主要技术流程

1、SMSCs及其衍生的外泌体的分离与鉴定:粒径及表面标记物检测

2、SMSC-Exos作用研究:可激活YAP,减少关节软骨细胞ECM分泌,诱导关节软骨细胞增殖和迁移

3、SMSC-Exos作用机制:通过Wnt5a和Wnt5b激活YAP起作用,是SMSC-Exos的主要效应分子

4、外泌体miR-140-5p筛选:miRNA微阵列

5、miR-140-5p体内/体外实验功能验证:miR-140-5p-inhibitor、miR-140-5p-antagomir(锐博生物提供)

6、SMSC-140-Exos治疗潜力


研究结果

SMSCs及其衍生的外泌体的分离与鉴定

从滑膜分离SMSCs,检测成骨,生脂和软骨形成潜能,并分析SMSCs表面标记。动态光散射(DLS),透射电子显微镜(TEM)及western blotting用于检测SMSCs分泌的粒子的特征。囊泡大小为30~150nm,被证实为空心球形微泡,外泌体表面标记物CD63, CD9, CD81和Alix的表达显著富集在外泌体(图1D-F),表明成功分离出外泌体。

为了确认软骨细胞是否可以摄取来自SMSCs的外泌体,在捕获外泌体前使用绿色荧光亲脂性染料(Vybrant DiO)标记SMSCs,在软骨细胞的细胞核周围区域有DiO标记的外泌体(图1G),证明软骨细胞确实可以内化外泌体。

SMSC-Exos作用研究

作者用不同浓度SMSC-Exos刺激软骨细胞,qPCR分析YAP下游靶标,结果表明YAP下游基因水平以剂量依赖性方式增强(图2A)。western blotting结果显示YAP通过去磷酸化作用被SMSC-Exos激活(图2B)。激活的YAP定位在细胞核中并激活待翻译的下游基因。流式细胞EdU检测显示软骨细胞的增殖能力通过SMSC-Exos显著增加,迁移能力明显加强(图2E);但是,qPCR和western blotting分析显示ECM分泌明显被SMSC-Exos抑制(图2G)。

SMSC-Exos作用机制研究

通过分析SMSCs中Wnt家族成员基因表达水平来阐明SMSC-Exos刺激软骨细胞产生这些结果的机制。结果发现Wnt5a和Wnt5b是高表达的(图3A);western blotting证实Wnt5a和Wnt5b的蛋白水平在SMSCs和外泌体中也是高表达的(图1F)。使用慢病毒shRNA抑制Wnt5a和Wnt5b的表达水平发现没有YAP的激活(图3C),也不增强增殖和迁移能力(图3E,F),抑制软骨细胞功能,包括ECM分泌(图3G)。表明Wnt5a和Wnt5b是SMSC-Exos的主要效应分子。

接下来,作者旨在阐明通过交替Wnt信号通路的YAP激活是否也对Wnt5a和Wnt5b引起的结果起作用。过表达S127A可产生持续的YAP活性,qPCR分析S127A转染效率发现YAP激活与SMSC-Exos刺激对细胞增殖、细胞迁移和软骨细胞功能,包括ECM分泌的作用相同(图4A-D)。

为进一步证实YAP是主要分子,设计两个YAP shRNAs并用qPCR验证抑制效率。结果表明shYAP转染的软骨细胞增殖和迁移能力弱,没有被SMSC-Exos增强(图4F-H);软骨细胞功能,包括ECM分泌由于YAP的下调受阻(图4I)。

使用可破坏YAP-TEAD的维替泊芬来验证YAP-TEAD复合物在影响软骨细胞ECM分泌中的作用。进一步确认SMSC-Exos抑制的ECM分泌可被维替泊芬rescue(图4K)。

外泌体miR-140-5p筛选

除了蛋白质,miRNA也是外泌体中另一个重要的分子。使用miRNA微阵列测量不同miRNA表达水平(图5A)。作者关注了高表达miRNA和miR-140-5p/miR-140-3p(图5B)。发现外泌体高表达miRNA与软骨细胞功能之间没有明显的联系。与软骨细胞功能密切相关的miR-140-5p很少在SMSC-Exos中表达。

接着,通过miR-140-5p过表达修饰SMSC-Exos。根据已有研究miR-140-5p可能靶向RalA来增强SOX9和蛋白多聚糖,作者设计shRalA,qPCR检测抑制效率(图5C)。结果表明miR-140-5p抑制RalA,上调SOX9, ACAN和collagen type II;RalA过表达可阻止这种效果。shRalA转染对miR-140-5p过表达有相似的作用(图5D,E)。

miR-140-5p体内/体外实验功能验证

构建miR-140-5p过表达的SMSCs并获得SMSC-140-Exos衍生的外泌体。SMSC-140-Exos处理的软骨细胞的miR-140-5p表达水平要高于SMSC-Exos处理的软骨细胞。与SMSC-Exos相比,SMSC-140-Exos在YAP激活,软骨细胞增殖与迁移有类似的效果(图6C,D);对ECM没有明显的抑制(图6E,F)。

为了证实miR-140-5p在SMSC-140-Exos中的功能。使用miR-140-5p-inhibitor和miR-140-5p-antagomir转染软骨细胞来阻止miR-140-5p。结果表明miR-140-5p可维持软骨细胞功能,包括ECM分泌(图6G)。

SMSC-140-Exos治疗潜力

作者验证了在OA大鼠模型中外泌体预防OA的潜力。发现在任何实验组都没有明显的不良事件发生。

对比OA组与OA+SMSC-Exos组,OA+SMSC-140-Exos组中关节磨损仍然存在,但严重程度十分轻微;II型胶原蛋白组成的软骨基质比正常组略微稀疏,但比OA组或OA+SMSC-Exos更好;蛋白多聚糖表达没有明显减少,软骨基质没有I型胶原蛋白表达。表明,SMSC-140-Exos可以缓解早期OA的进展,防止膝关节不稳定引起对膝关节软骨的严重损伤(图7A)。




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