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锐博生物EdU助力胃癌肝转移的研究

发布日期:2017/12/25 17:22:32      浏览量:

 胃癌(GC)向肝脏转移是末期胃癌发展的主要形式,但其过程的机制依然不明。天津医科大学肿瘤医院证实被转运的EGFR能通过抑制miR-26a/b的表达来有效地影响肝细胞生长因子(HGF)。相关研究结果以Exosome-delivered EGFR regulates liver microenvironment to promote gastric cancer liver metastasis为题发表在最新一期的Nature Communications期刊上。

摘要

癌细胞转移的器官偏向性是自“seed and soil”假设提出后,癌症最不为人所了解的事情。尽管EGFR在癌细胞中的作用已被广泛研究,但人们对由外泌体运输的分泌型EGFR的作用却所知甚少。本文揭示了外泌体中,由胃癌细胞分泌的EGFR能被运输到肝脏并整合至肝基质细胞的细胞膜中,证实被转运的EGFR能通过抑制miR-26a/b的表达来有效地影响肝细胞生长因子(HGF)。此外,旁分泌HGF(与转移的癌细胞上的c-MET受体结合)的上调为“种子”提供了肥沃的“土壤”,促进了迁移癌细胞的定位与增值。因此,研究者认为,从癌细胞分泌的含有EGFR的外泌体,有助于肝脏微环境的发育,从而引发癌细胞的肝脏特异性转移。

技术路线


研究结果

EGFR在GC的外泌体中

图1

研究者分别在20例GC患者和正常人中分离血清外泌体(sr-exosome),发现GC患者外泌体中的EGFR比正常人要多,提示着这些在患者外泌体中的EGFR或对GC的发展起着重要作用(图1a,b)。

免疫组化与western blotting结果检测30个GC肝转移瘤的患者HGF的表达,结果发现HGF并没有在GC转移瘤中高表达,(图1c,d)但其受体,c-MET和磷酸化c-MET(p-c-MET)则在GC肝转移瘤中明显表达,HGF的阳性率只有15%,但c-MET的阳性率则有90%(图1e)。

以上结果表明,转移瘤中的癌细胞与肝HGF结合,并通过旁分泌的方式释放到肝脏微环境中。


外泌体介导的EGFR定位于肝细胞膜

图2

作为膜蛋白,EGFR在其靶细胞上的定位对其功能的发挥极为重要。研究者将从SGC7901细胞中抽提出来,含有绿色荧光蛋白(GFP)标记的EGFR的外泌体(SGC-exosomes)与小鼠初级肝细胞共孵育(图2c),发现这些外泌体很快就进入了受体细胞中(图2d)。如研究者所料,GFP标记的EGFR在肝细胞外膜被检测到(图2e),提示着膜蛋白EGFR能被SGC外泌体运输进肝细胞,并通过与细胞膜融合定位于其上。

外泌体EGFR通过抑制miR-26a/b来激活肝HGF

图3

在SGC外泌体与初级肝细胞共孵育的试验中,当EGFR被从外泌体中去除时,HGF的表达则被阻断了,相反,当EGFR过表达时,HGF则被上调(图3a,c),但有趣的时,如果外泌体与EGFR都过表达,HGF mRNA的水平反而没有显著的变化,因此研究者相信,EGFR是通过抑制HGF上游的miRNA来激活肝HGF的。通过生物信息学的方法,他们找到了两个在GC中表达下调的miRNA:miR-26a和miR-26b(图3h)。

图4

在之后的实验中,研究者通过荧光素酶报告质粒来验证了miR-26a/b与HGF的关系,证明了miR-26a和miR-26b在初级肝细胞中通过直接靶向HGF的3’-UTR来调节HGF的表达(图4c,4d)。

HGF在体外调节GC细胞的生物学行为(相关产品由锐博生物提供)

图5

那么HGF在GC细胞上发挥着什么样的作用呢?研究者通过EDU(锐博生物提供)和Transwell 试验发现,过表达HGF和用SGC处理过的初级肝细胞都表现出强烈的增殖、迁移和侵袭。而用HGF shRNA处理的肝细胞则相反(图5e-g)。这些结果表明,肝HGF在调节GC细胞的生物行为上起着关键作用。

体内验证肝HGF在肿瘤肝转移中的作用

图6

为了进一步在体内验证HGF在肿瘤肝转移中所起的作用,研究人员构建了小鼠模型。在移植GC前,通过多点注射的方法,小鼠的肝脏先用HGF过表达序列或HGF shRNA来处理(实验流程如图6a所示)。在实验组小鼠的肿瘤和外泌体中都检测到了高表达的EGFR(图6b,c)。如实验人员所料,移植了肿瘤的小鼠,肝HGF的表达被上调,而注射了HGF shRNA慢病毒的小鼠,其HGF的表达水平则受到抑制;与此同时,EGFR的表达也随着肿瘤的移植而上升(图6d),并且小鼠血清中高水平的外泌体EGFR使得miR-26a/b被抑制(图6f)。

肝HGF在趋肝性肿瘤转移中的作用

图7

最后,研究者还评估了HGF在GC肝转移瘤和小鼠生存期中的作用。实验证明,上调肝HGF能引发肿瘤向肝脏转移,而下调肝HGF则能抑制肿瘤向肝转移(图7a,b)。一系列的实验表明,肝HGF与小鼠模型中的肿瘤肝转移过程关系密切。




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