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circRNA MTO1通过ceRNA机制与miR-9结合来抑制肝细胞癌的病程发展

发布日期:2017/12/25 17:09:02      浏览量:

 环状RNA(circRNA)作为一类新发现的内源性非编码RNA,近年来倍受人们的关注,尤其在癌症的病程发展方面。今天,小编为大家带来了曹雪涛院士今年5月,于国际肝脏学顶尖杂志Hepatology在线发表的一篇关于circRNA的文章。

摘要

本文分析了人HCC组织中的circRNA表达谱,鉴别出circMTO1这个显著下调的circRNA,并且发现circMTO1表达水平低的HCC患者其生存期也较短。通过生物素标记的circMTO1探针在HCC细胞中做体外的RIP,研究者发现了circMTO1的关联miRNA——miR-9,而在HCC中沉默circMTO1能使miR-9的靶基因p21下调,导致HCC细胞的扩散和迁移。此外,miR-9抑制剂能阻碍因肿瘤而促进的circMTO1沉默效应。最后的体内实验也表明,利用胆固醇标记的circMTO1的siRNA来抑制circMTO1能促进HCC肿瘤的生长。

实验流程与技术

研究结果

1.circMTO1在HCC肿瘤组织中表达下调

图1

通过在HCC肿瘤与非肿瘤组织中进行circRNA芯片分析,研究者分别找到了10个表达上调或下调变化显著的circRNA(Fig.1A),然后在21位患者的HCC组织中验证,从这20个中找到变化最大的6个circRNA;又在这6个circRNA中锁定了circMTO1,因为它在HCC肿瘤组织中始终显著地降低(Fig.1B)。为了进一步验证,研究者在261例HCC患者的样本中检测其表达量,发现circMTO1在87.4%(228例)的样本都是低表达的(Fig.2A,Fig.2B)。一系列的实验结果,让研究者把重点聚焦在了研究circMTO1在HCC病程的生物学意义上。

2. circMTO1的表达下调与HCC患者的不良预后显著相关

图2

研究者收集了116例HCC患者的生存期数据,并且通过在组织芯片上做原位杂交(ISH),与对照的无肿瘤组织相比,发现circMTO1在这些样本中依然是显著下调的(图2C),并且circMTO1的下调与HCC患者的不良预后显著相关(图2D,2E)。

3. 在HCC细胞中,circMTO1与miR-9结合


图3

通过MiRanda Program的预测,有99个miRNA可能是circMTO1的靶标。研究者利用circMTO1特异性的探针进行RNA  in vivo precipitation(RIP),来寻找真正与circMTO1结合的miRNA,加上之前的预测结果,范围缩小到了20个miRNA。通过RIP circMTO1 pull down试验发现了一共特异性富集的miRNA——miR-9(图3A,3B),它在之前的研究中已经被报道在HCC组织中表达增加。通过FISH,研究者发现circMTO1与miR-9共定位于胞浆中(图3C),以上的实验结果表明,circMTO1与miR-9在胞浆中结合。

4. circMTO1通过ceRNA机制结合miR-9,使p21上调,从而抑制了HCC癌症的进展


图4

研究者通过沉默circMTO1来研究它与HCC癌症病程及miR-9的关系(Fig.4A),发现在HepG2和 SMMC-7721细胞中,沉默circMTO1表达会促进细胞的增殖及其迁移并抑制凋亡(Fig.4B-D)。而在QGY-7701和SK-Hep1 HCC细胞中过表达circMTO1则会促使细胞凋亡(Fig.4D)。而且进一步验证发现,circMTO1对miR-9的表达水平没有影响,更加证实了circMTO1通过ceRNA机制来抑制HCC病程。

随后,研究者还对miR-9的靶基因——抑癌基因p21进行了研究。无论是沉默circMTO1或者过表达miR-9,都会使p21的mRNA和蛋白表达水平降低,而过表达circMTO1则会其相反的结果(Fig.4E,Fig.4F)。这些结果提示着,circMTO1通过结合miR-9导致p21表达增高来抑制癌症的发展。

在肝癌细胞中,抑制miR-9的表达可以明显减弱在circMTO1表达下调时介导的对p21蛋白及其mRNA水平的表达抑制效果。另外miR - 9抑制剂显著地阻断了circMTO1沉默介导的细胞增殖和抑制凋亡的作用Fig.5D,Fig.5E)。这些结果证明了,circMTO1通过circMTO1/miR-9/p21这条通路来抑制HCC的病程发展。

5.体内knockdown circMTO1导致HCC的生长(相关in vivo siRNA由锐博生物提供)

图5

最后,研究者进行了活体实验,通过皮下移植人类HCC组织来构建HCC裸鼠移植瘤动物模型(SMMC-LTNM)。向小鼠的肿瘤持续地注射胆固醇标记的circMTO1 siRNA两周后,研究者发现小鼠的肿瘤生长速度明显加快了,并且血清AFP也升高了(图5A,5B)。而注射后的48小时后,就能检测到circMTO1和p21在SMMC-LTNM小鼠肿瘤组织中明显的下降(图5C)。此外,体内knockdown circMTO1后,p21和下游的CDK2的表达也被抑制了,而细胞迁移和扩散的标记物MMP2和PCNA则被上调(图5D)。这些结果表明,circMTO1在体内能抑制HCC的发展。




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