请登录|免费注册|
ENGLISH 简体中文
您当前的位置:首页 > 技术资源 > 技术前沿

lnc-mg 通过ceRNA机制与miRNA-125b互作促进骨骼肌细胞的生长

发布日期:2017/12/25 16:43:56      浏览量:

 暨南大学生命科学技术学院王晓刚副研究员课题组于今年3月份在著名期刊杂志《Nature Communication》上发表了关于lncRNA作为ceRNA调控机制研究的文章。

研究背景

骨骼肌减少症(Sarcopenia)是一种增龄性肌肉退行性疾病,表现为骨骼肌萎缩、肌力和机体运动功能下降。目前,提高骨骼肌再生能力是对抗骨骼肌减少的主要策略。一些lncRNA被发现调控肌肉生成, 其中有正调控,如:lncRNA H19、MUNC、LncMyoD、lnc-MD1等;也有一些lncRNA对于肌肉生成起着负调控作用,如:m1/2-sbsRNA、lnc-31、Yam等。 尽管这些lncRNA的功能在体内和体外试验中部分得到证实,但它们在肌生成上所扮演的角色依然有待研究。王晓刚副研究员课题组以骨骼肌再生为切入点,率先筛选了骨骼肌干细胞分化过程中差异表达的长链非编码RNA分子(lncRNA),发现了一个新的lncRNA分子并命名为lnc-mg。lnc-mg可以促进骨骼肌干细胞分化和骨骼肌再生,该课题组率先提出:新鉴定到的lnc-mg表达下调是骨骼肌减少症中肌肉再生障碍的重要原因。该分子的发现及机制研究有望为骨骼肌减少症的治疗提供新的药物靶点。

科学理论

本文描述了小鼠肌生成相关的lncRNA(lnc-mg)。进一步揭示了lnc-mg启动肌生成和增强体内的肌肉质量。作用机制上的研究表明,lnc-mg以作为microRNA-125b的内源性竞争RNA(ceRNA)的形式来操纵胰岛素样生长因子2蛋白的丰度,从而引发肌细胞的生长。

技术路线

研究结果

lncRNA芯片筛选与肌生成相关的lncRNA(lncRNA芯片检测服务由锐博生物提供)

图1

从原始和分化的肌肉干细胞(MuSC)中获得的微阵列数据显示,有70个lncRNA上调了,12个下调。(图1a),在这些变化的lncRNA中研究人员找到了名为lnc-mg的lncRNA,它富含在骨骼肌中(图1b),并发现它在不同类型的肌肉中的表达水平基本一致(图1c)

lnc-mg体外细胞功能研究 

图2

体外功能验证上,研究者一方面利用RNA干扰来knock down lnc-mg(图2a),另一方面通过过表达载体(图2e)来研究lnc-mg在体外的肌生成过程中所扮演的角色。发现抑制 lnc-mg表达后MuSC的分化被明显抑制了(图2b);而过表达lnc-mg则加速了MuSC的分化(图2f)。

lnc-mg体内功能研究与验证

图3

为了进一步研究lnc-mg的体内功能,研究者构建了骨骼肌条件性敲除lnc-mg的小鼠模型。与对照小鼠(lnc-mgfl/fl)相比,敲除了lnc-mg的小鼠的腓肠肌(GAS)、比目鱼肌(SOL)、伸缩肌(EDL)、胫骨前段(TA)的重量都比较低(图3a);而且GAS的横截面的肌肉纤维也比对照组小鼠的要小(图3b,c)。

图4

研究者进一步构建了lnc-mg骨骼肌特异性表达的转基因小鼠,发现GAS、SOL、EDL和TA的重量都比野生型(WT)的小鼠要高(图4a);而且其肌纤维的很断面也明显要更大(图4b,c)。

lnc-mg的ceRNA作用机制验证(miRNA芯片、agomir、antagomir由锐博生物提供)

图5

研究人员假设lnc-mg有ceRNA的功能,能释放miRNA的靶基因转录本。为了验证这一假说,研究者利用微阵列分析来检测miRNA在过表达lnc-mg和lnc-mg knockdown的C2C12细胞中的表达(相关服务由锐博生物提供)(图5a)。在候选的miRNA中,研究者发现当lnc-mg过表达的时候miR-125b被大幅下调,而当lnc-mg被knockdown的时候,miR-125b则大幅上调(图5b)。

图6

为了进一步验证lnc-mg与miR-125b之间的互作,研究者进行了Ago2免疫沉淀反映和实时PCR(图6i,j)。

图7

先前的研究表示,miR-125b通过直接靶向Igf2来对肌细胞的分化起负调节的作用。因此,研究者在lnc-mg过表达和knockdown的C2C12细胞中对Igf2进行检测。Western blotting的结果显示,Igf2在lnc-mg knockdown的细胞中被下调,而在lnc-mg过表达的细胞中则被上调(图7k)。

图8

为了进一步证明lnc-mg在体内是miR-125b的ceRNA,研究者利用实时PRC检测了lnc-mgskl-/-小鼠的miR-125b的水平,发现与对照的lnc-mgfl/fl小鼠相比,其GAS中的miR-125b表达更高(图8a),相反地,Western blotting和ELISA的结果提示着Igf2蛋白则更低(图8b,c)。

 

lncRNA作为ceRNA机制调控研究技术路线四部曲

一、表达差异筛选及、验证及其亚细胞定位:

1、lncRNA-seq进行表达谱差异筛选,对候选基因进行lncRNA-miRNA联合生信分析,确定候选的lncRNA

2、qRT-PCR检测lncRNA、miRNA及其miRNA调控下游靶基因的表达;

3、Fish实验检测lncRNA的亚细胞定位;

二、LncRNA细胞功能研究:

lncRNA高表达或抑制及其miRNA高表达及其抑制对cell的表型影响;

三、LncRNA作为ceRNA调控机制验证:

1、荧光报告基因实验验证lncRNA作为miRNA的ceRNA的调控;

2、IP实验验证lncRNA与miRNA是通过AGO2蛋白形成RISC复合体发生的相互作用;

四、LncRNA动物体内功能研究:

体内动物实验评价lncRNA及其miRNA对疾病模型的影响;

以上实验设计涉及的产品或者实验服务,锐博生物均可以提供!




版权所有:广州市锐博生物科技有限公司 Copyright©2013 Guangzhou RiboBio Co., Ltd.  免费热线:400-686-0075
地址:广州开发区科学城科学大道182号创新大厦C3区13-14层   邮编:510663   粤ICP备05022931号   浏览器建议:IE8.0 1024X768分辨率
.
主营产品及服务:piRNA  寡核酸  siRNA  miRNA  microRNA   RNAi  shRNA  lncRNA  ncRNA  细胞增殖  生物芯片  高通量测序