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锐博生物ChIP-seq助力细胞转分化的重大发现,研究成果在《Cell Research》上发表

发布日期:2017/3/30 15:07:05      浏览量:

2017127日,国际学术权威刊物自然出版集团旗下子刊Cell ResearchIF14.812)在线发表了浙江大学医学院干细胞与再生医学中心郭国骥教授课题组和哈佛大学医学院Stuart H Orkin实验室合作的题为A molecular roadmap for induced multi-lineage transdifferentiation of fibroblasts by chemical combinations的研究论文。

该研究发现,利用小分子组合能将小鼠成纤维母细胞同时转分化为来自三个胚层的多种成体细胞。利用这一机制,郭国骥课题组与浙大医学院段树民实验室及哈佛医学院Orkin实验室展开合作,优化出了小鼠成纤维细胞分别向胶质细胞、肌样细胞和脂肪细胞定向转分化的高效诱导条件。研究首次提出多向转分化(iMT)的概念,只需调整培养体系便能高效率地直接定向转分化得到特定的细胞,为再生医学研究提供了一种解决细胞来源的新方法。

研究背景

小分子化合物作为基因掌控细胞命运的得力助手,能透过细胞,而且比转录因子更易控制和更具成本效益。一些化学物组合已被报道称有助于细胞的重编程,如激发神经元的转化,而在用小鼠和人的成纤维母细胞来制备有功能的心肌细胞的研究也取得了类似的进展。有趣的是,很多这类的研究都用了相似的化学物质,却得出了不同的结果,它们背后的机制依然不为人们所知。单个或组合形式的小分子物质的功能有待进一步研究,而且其在单细胞化学重编程过程中的分子通路也有待剖析。

本文阐述了一条小鼠成纤维母细胞(MEFs)在化学物质组合下被激发成iMTinduced multi-lineage trans-differentiation iMT)的状态,从而向多个特殊的细胞系转分化的途径。

研究思路与所用技术

1.  通过表型筛选鉴别出引发成纤维母细胞向多个细胞系转化的化学物组合

研究人员首先将一整套与细胞重编程有关的化学物质以单个或组合的形式加入MEFs中,通过表型筛选鉴别出引发MEFs向多个细胞系转化的化学物组合。

接着通过qPCR分析细胞系特异性标记物、流式细胞术(FACS)来筛选出作用最强劲的小分子化学物组合。

在进行了一系列试验和数据分析后,研究人员发现,6TCFSGCF这两组化学物作用最为强劲。他们把这种一步就使细胞向多方向转分化的过程称为多向转分化(induced multi-lineage trans-differentiationiMT

2.通过iMT得到多种体细胞

随后,研究人员通过免疫染色、细胞电生理试验等方法鉴定了通过iMT得到的多种体细胞。

3.在iMT的分子通路中鉴定出重要的调控因子Sox2

接下来,研究者开始对iMT的分子机制进行研究。利用基因表达芯片,time course(时间序列样本)分析、GSEA(基因富集)分析等技术在iMT的分子通路中鉴定出重要的调控因子:Sox2

4.在iMT过程中,主要的调控因子改变了其表观遗传状态

为了进一步探究主要的调控因子在iMT过程中所发生的表观遗传状态的改变,研究者进行了ChIP-SeqGOGene Ontology)分析测序服务及其生物信息分析由锐博生物提供),以 H3K4me3H3K27me3蛋白进行CHIP,构建Chip-seq文库并进行测序及分析,验证了这些关键调控因子的表观修饰。

与此同时,研究者用DNA甲基化焦磷酸测序的方法,发现了在6TCF处理6天的MEFs中,Sox2基因的3个区域甲基化水平下降,证实了Sox2iMT过程中起着关键作用。

5. 单细胞分析揭示iMT启动细胞向不同状态改变

为了对从iMT转分化所得到的细胞与原来组织中的细胞进行比较,研究者制备了小鼠胚胎心脏的单个细胞和成鼠的星形胶质细胞以作对照。t-SNE projectioncircular dendrogram都显示iMT转分化得到的GFAP+单细胞极像成鼠的星形胶质细胞,而转分化得到的肌样细胞极像胚胎心肌细胞。

6.优化后的iMT培养体系能使MEFs定向转化成源性肌样细、质细胞和脂肪细胞

研究人员推测,对iMT系统中的化学物质组合进行调整,以及逐步改变培养条件,应该能使MEFs向着特定单一类型的细胞转化,为了验证这个猜想,他们调整了6TCF中的4个化学物质,变为6OTCFW,使得ANF-GFP MEFs向心脏细胞定向转分化。此外,研究者还建立了有心肌疾病的小鼠模型,并将这种由iMT得到的心脏细胞移植到小鼠体内,结果发现在修复区的心肌源性细胞显著增加。

小编Tips

染色质免疫共沉淀ChromatinImmunoprecipitation, ChIP)是研究蛋白质与DNA相互作用的经典实验方法,广泛的应用于组蛋白特异性修饰位点、转录因子结合位点等研究。随着新一代测序技术的成熟与发展,整合了染色质免疫共沉淀与高通量测序技术的ChIP-Seq,是继ChIP-chip之后,蛋白质与DNA相互作用研究的又一技术突破。ChIP-Seq采用特异抗体对目的蛋白进行免疫沉淀,分离与目的蛋白结合的基因组DNA片段,对其进行纯化和文库构建,再通过高通量测序的方法,在全基因组范围内寻找目的蛋白的DNA结合位点,从而获得全基因组范围内与组蛋白、转录因子等互作的DNA片段信息。

本文由锐博生物提供ChIP-seq实验服务流程:

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